北京白癜风最好的医院 http://www.xftobacco.com/m/外周神经损伤是一种常见的疾病，在临床上可分为两类，一类是非开放性损伤，大多由神经周围软组织非开放性损伤导致神经被压迫、牵拉，使神经内发生水肿变性等，最终导致神经功能障碍。另一类是开放性损伤，随着科技进步、社会经济的高速发展，由开放性损伤引起的神经性疾病越来越多。神经损伤后会造成躯体感觉、运动和自主神经的功能减退、增强或丧失，会表现出躯体疼痛，运动功能障碍而最终造成残疾。周围神经损伤后发生神经传导中断，神经内水肿和Waller变性等病理改变。研究表明神经元和免疫细胞之间的相互作用，以及它们的交流和功能合作，是其在体内平衡和存活的必要条件。基于此，许多团队展开了研究，望探究神经损伤修复的内在机制，早日治愈神经损伤患者。
近日，青岛大学的研究团队CuiML等人于年7月在Int.Immunopharmacol上发表题为“NLRP3inflammasomeisinvolvedinnerverecoveryaftersciaticnerveinjury.”的研究文章，揭示了NLRP3炎症体参与坐骨神经损伤后的神经恢复的机制及其作用。
坐骨神经是人体内最大的神经，起源于下背部，并通过下肢向后延伸至脚后跟底部。坐骨神经不仅为大腿后部提供运动神经支配，还为脚和小腿的皮肤提供感觉神经支配。在本文研究中，作者尝试使用坐骨神经损伤的动物模型（包括C57BL/6WT小鼠和NLRP3-KO小鼠）以评估NLRP3炎性小体是否参与坐骨神经损伤后的炎症反应，并证明NLRP3炎性小体与神经损伤恢复之间的关系。
为了研究NLRP3在坐骨神经损伤修复中的潜在作用，我们建立了野生型小鼠坐骨神经损伤模型。在实验中，WT小鼠被随机分为对照组和损伤组。此外，NLRP3-KO小鼠随机分为NLRP3-KO对照组和损伤组。每个时间点每组9只小鼠进行研究。按照以下程序建立坐骨神经损伤模型，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，用剃刀剃除大腿皮肤及其周围区域，用75%的乙醇消毒，将皮肤层和肌肉在无菌实验环境下分离暴露坐骨神经，用止血钳在暴露的坐骨神经中部钳夹60秒，使坐骨神经的神经束遭到破坏，而神经外膜保持完整，对照组小鼠仅暴露坐骨神经，不予以夹伤。然后用6-0无损伤缝合线逐层关闭切口缝合筋膜和皮肤，碘伏消毒2遍缝合伤口，待术后清醒正常饲养。
（A：坐骨神经夹伤前，可见神经组织完整B：夹伤后可见神经束被损伤，而神经外膜完整）
为了检测神经损伤后对炎性因子表达调控的影响，作者首先利用RT-qPCR检测坐骨神经损伤后IL-1β，caspase-1，NF-kB的mRNA表达量。结果显示，野生型小鼠坐骨神经损伤后NLRP3、IL-1β、caspase-1、ASC和IL-18mRNA水平显著升高，24h达到顶峰后开始下降。而坐骨神经损伤后，其他炎性成分如IL-18和caspase-1与对照组相比则没有显着变化。此外，通过Westernblot也验证了坐骨神经损伤的WT小鼠中NLRP3，proIL-1β和成熟IL-1β的水平升高，损伤小鼠procaspase-1，caspase-1，ASC和IL-18的蛋白质水平高于对照组。上述结果表明，坐骨神经损伤后形成并激活了NLRP3炎性体。
（A：RT-qPCR结果B、C：Westernblot结果）
HE染色及LFB染色结果如下，he染色结果显示神经损伤小鼠出现明显炎症细胞浸润，与12h相比24h炎症反应更为严重。Lfb染色可见神经髓鞘被染成天蓝色，坐骨神经损伤后小鼠坐骨神经组织髓鞘与对照组相比明显较少。这些结果加在一起表明坐骨神经损伤后发生了沃勒氏变性和炎症。
（A：HE染色结果B：LFB染色结果）
坐骨神经损伤后细胞外ASC斑点的积累
ASC被证明是炎症体的“桥梁”，是炎症体的重要组成部分。炎症激活后，ASC可以组装成称为“ASCSpeck”的大型蛋白质复合物。在我们的研究中使用免疫荧光来显示炎症小体的激活，从对照组和受伤的WT小鼠中提取坐骨神经，并用抗ASC抗体对坐骨神经横截面进行免疫荧光染色。结果显示ASC在对照组细胞中分布均匀，在损伤组中重新分布而形成病灶或斑点。聚集的ASC和较大的ASC斑点积累进一步表明，NLRP3炎症小体在坐骨神经损伤后被激活。
NLRP3缺乏可减轻坐骨神经损伤后的炎症反应
由于坐骨神经损伤可引起炎症反应，而NLRP3炎症小体在神经损伤后被激活，我们接下来尝试在NLRP3-KO小鼠中探讨坐骨神经损伤后的炎症变化。染色显示神经挤压损伤后发生脱髓鞘和Waller变性。随后，对WT小鼠和NLRP3-KO小鼠坐骨神经纵向切片进行HE染色。通过HE染色，我们发现神经粉碎损伤24h后，在NLRP3-KO小鼠中也观察到坐骨神经的炎症，但浸润细胞数明显低于WT小鼠。此外，我们用免疫荧光染色CD68巨噬细胞，观察到NLRP3-KO小鼠巨噬细胞浸润程度低于WT小鼠。
（A：HE染色结果B：LFB染色结果C：免疫荧光染色CD68（红色）和DAPI（细胞核，蓝色）
NLRP3缺乏可降低坐骨神经损伤后炎症成分和下游炎症因子的水平
先前实验我们已经发现坐骨神经损伤刻导致NLRP3和NLRP3炎症相关成分的表达增加。为了进一步探讨NLRP3炎症体在神经损伤后的作用，使用NLRP3-KO小鼠重复上述实验。RT-qPCR结果表明，NLRP3在任何时间点(6h，12h，24h，48h)均不表达)。各个时间点NLRP3-KO小鼠IL-1β的mRNA水平均较低。然而，ASC和caspase-1的表达仅在24h和48h时较低，IL-18的表达仅在NLRP3-KO小鼠神经损伤后48h时较低。正如预期的那样，在NLRP3-KO小鼠中没有观察到NLRP3蛋白。神经损伤后24hNLRP3-KO小鼠caspase-1和ASC蛋白水平下调，炎症因子IL-1β和IL-18在NLRP3炎性体下游的成熟形式在NLRP3-KO小鼠中的水平低于WT小鼠，这些结果表明，NLRP3基因的敲除降低了NLRP3炎症组分的表达和下游炎症因子的产生。
坐骨神经损伤后NLRP3-KO小鼠中GAP-43和p75NTR均高表达
GAP-43和p75NTR在神经再生和修复中起着重要作用。这些蛋白质可以促进突触重建、轴突再生、神经递质释放和神经元信号转导。为了研究坐骨神经损伤后WT和NLRP3-KO小鼠坐骨神经的修复和再生，我们采用免疫印迹法检测p75NTR和GAP-43蛋白的表达。坐骨神经损伤后，在神经损伤后12h和24h，NLRP3-KO小鼠的p75NTR蛋白水平明显高于WT小鼠，而GAP-43无差异。在神经损伤后24h，免疫组织化学也得到了相同的结果。此外，我们还监测坐骨神经的长期修复。为此，在坐骨神经损伤1周后，用免疫印迹法测定GAP-43和p75NTR蛋白水平。结果表明，NLRP3-KO小鼠GAP-43和p75NTR蛋白水平明显高于WT小鼠。此外，用免疫组织化学方法测定了神经损伤后GAP-43和p75NTR2和3周的蛋白质水平，NLRP3-KO小鼠的蛋白质水平高于WT鼠。上述结果表明，NLRP3-KO小鼠的GAP-43和p75NTR水平高于WT小鼠。注意神经损伤后GAP-43表达12h和24h无差异。
NLRP3-KO小神经损伤后鼠运动恢复较好
足印SFI分析可反映坐骨神经再生程度，被认为是一种可靠的评价神经再生和功能恢复的方法再生和功能恢复。我们使用SFI评估坐骨神经损伤后小鼠运动功能的恢复，发现NLRP3-KO小神经损伤后鼠运动恢复较好
(从左到右，对照组神经图、损伤组神经图和神经损伤后1周收获的神经图）
这篇文章成功构建了小鼠坐骨神经损伤模型，为神经损伤后修复机制研究提供实验模型。并发现坐骨神经损伤后NLRP3炎症小体被激活，敲除小鼠NLRP3基因可以减少炎症反应，促进恢复坐骨神经损伤。这一发现表明了NLRP3在坐骨神经修复中的作用，阐明了可通过抑制NLRP3来减少炎性因子的合成分泌或释放，从而加快小鼠坐骨神经的损伤修复的机制。
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